O entupimento da coluna cromatográfica é responsável por mais da metade de todas as falhas desse equipamento. Portanto, a filtração completa (0,2 μm) de fases móveis e amostras é a chave para uma longa vida útil da coluna.
A compatibilidade da fase móvel é outro fator importante. Fases estacionárias RP padrão são estáveis sob pH 1,5 a 9. Sob certas condições (buffers orgânicos), as fases estacionárias são quimicamente estáveis até pH 12. Geralmente, os tampões orgânicos são mais suaves em relação à fase estacionária à base de sílica do que os inorgânicos, como os fosfatos ou carbonatos. Para executar um método em pH alto, deve-se escolher uma coluna cromatográfica que é estável até pH 12.
Além disso, as colunas nunca devem ser deixadas em uma fase móvel em buffer quando o fluxo é interrompido por mais de 10 minutos. Escolha uma taxa de fluxo muito baixa (0,1 ml / min para uma coluna ID de 4,6 mm) em vez de parar o fluxo completamente ou troque qualquer fase móvel tamponada por uma não tamponada (por exemplo, água / acetonitrila 70/30). Isso evitará que a coluna seja obstruída com sais de tampão precipitados.
Como a coluna cromatográfica deve ser armazenada?
O armazenamento correto da coluna cromatográfica é um pré-requisito para uma cromatografia sem problemas e uma longa vida útil da coluna. As colunas de fase normal devem ser armazenadas em heptano / 2-propanol ou outro solvente inerte sem aditivos.
As fases estacionárias de fase reversa devem ser mantidas em uma mistura de água / modificador orgânico, livre de quaisquer tampões ou aditivos que possam precipitar durante o armazenamento. Assim, recomenda-se lavar a coluna sempre que a cromatografia for ser interrompida por mais de 15 min com modificador água / orgânico 50/50, independentemente de a coluna ser separada do instrumento de HPLC ou não. Se a cromatografia for interrompida por apenas algumas horas, pode ser menos trabalhoso manter o tampão contendo a fase móvel funcionando a uma taxa de fluxo muito baixa. Se a coluna estiver destacada, feche a entrada e a saída com um parafuso para evitar que a fase estacionária seque.
Todas as colunas de HPLC devem ser armazenadas em temperatura ambiente (18-26 ° C), sem risco de choque mecânico, preferencialmente na caixa original da coluna cromatográfica.
Indicações para instalação correta de uma coluna cromatográfica HPLC Kromasil
Volume morto do sistema:
Reduza o volume morto no sistema ao mínimo usando um tubo de conexão de pequeno diâmetro interno, para colunas analíticas de 0,010 “. Mantenha esses comprimentos de tubo entre o injetor, a coluna e o detector o mais curto possível.
Conexão de coluna:
Para um desempenho ideal, é importante que o tubo usado para conectar a coluna ao injetor ou detector seja encaixado na posição de modo que encoste no ombro interno da conexão.
Equilíbrio:
O solvente de armazenamento em uma nova coluna é a fase móvel usada para avaliar a coluna, a menos que especificado de outra forma no cromatograma. Inicialmente, deve-se ter cuidado para não passar pela coluna qualquer material que possa precipitar no solvente de armazenamento. Certifique-se de que a coluna está totalmente equilibrada para a fase móvel antes de iniciar uma análise. Uma coluna de sílica de fase normal geralmente requer mais condicionamento do que uma coluna de fase reversa. A direção do fluxo é marcada na coluna.
Teste de performance:
Recomenda-se que o desempenho das colunas seja testado na chegada e em intervalos periódicos durante o uso. Os parâmetros de desempenho medidos são definidos acima.
Fator de assimetria: Como 0,1 = B / A
Segurança
Pressão máxima de operação = 400 bar (≈ 6000 psi)
Temperatura máxima = 60 ° C
Diretrizes operacionais
Solventes de HPLC:
Use apenas solventes de grau HPLC e soluções tampão aquosas preparadas de fresco para minimizar o crescimento bacteriano. Um filtro de entrada da bomba deslizante removerá as partículas estranhas.
PH da fase móvel: O pH da fase móvel recomendado para colunas Kromasil empacotadas com as fases C4, C8, C18 e NH2 está entre 2 e 9,5. Isso garantirá a vida útil máxima da coluna.
Pressão:
A exposição de uma coluna a mudanças rápidas na contrapressão ou a pressões superiores a 400 bar / 6000 psi pode reduzir a vida útil da coluna.
Armazenar:
Lave toda a água e tampões das colunas de sílica e armazene em solvente orgânico. As colunas de sílica não ligada podem ser armazenadas em hexano ou solvente orgânico semelhante. Mantenha em um local fresco e recoloque as tampas para evitar que a base de embalagem seque.
Dano mecânico:
Proteja a coluna de choques mecânicos. Deixar cair ou bater em uma coluna pode prejudicar seu desempenho.
Conexões – torque:
O aperto excessivo das conexões da extremidade da coluna resultará em danos à tubulação ou às conexões da coluna. A remoção de uma conexão de extremidade para substituir uma frita ou completar o material de embalagem deve ser considerada como o último recurso para prolongar a vida útil da coluna.
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