O que é cromatografia de fase reversa?

O que é cromatografia de fase reversa?

A cromatografia de fase reversa (RPC) é uma técnica de cromatografia líquida que envolve a separação de moléculas com base em interações hidrofóbicas entre as moléculas de soluto na fase móvel e os ligantes fixados na fase estacionária.


Conceito de fase reversa

Em modelos clássicos de cromatografia, a fase estacionária é uma fase polar e a fase móvel é um solvente orgânico apolar. Os constituintes polares dissolvidos na fase móvel tendem a ser atraídos para a fase estacionária polar, enquanto os constituintes não polares tendem a ser eluídos junto com o solvente.

Isso forma a base para a separação. Isso é conhecido como cromatografia de fase normal. Uma variedade de propriedades biológicas que variam de troca iônica a afinidade biológica têm sido usadas para a separação de moléculas.

Em RPC, alquil ou ligantes aromáticos são covalentemente ligados à fase estacionária para fornecer uma superfície hidrofóbica. A fase móvel que passa pela fase estacionária hidrofóbica é um solvente polar que contém os solutos.

Nesse cenário, os solutos hidrofóbicos na fase móvel tendem a se ligar à fase estacionária por meio de interações hidrofóbicas e, portanto, formam a base da separação. Como o princípio aqui é o oposto do que tem sido usado há muito tempo na cromatografia clássica, isso é conhecido como cromatografia de “fase reversa”.


CROMATOGRAFIA POR INTERAÇÕES HIDROFILICAS (HILIC): EST
Imagem: Scielo


A matriz em cromatografia de fase reversa

A composição química da matriz base é importante no RPC, pois deve ser química e estruturalmente estável. A sílica e o poliestireno sintético atendem a esses requisitos e são frequentemente usados ​​como materiais de matriz RPC.

O tamanho de partícula dos grânulos é baseado nos requisitos específicos da separação. O tamanho maior do cordão implica em capacidades maiores e pressões potencialmente menores. Os processos preparativos em grande escala se beneficiam do uso de pérolas de diâmetro maior que 10 μm; As separações preparativas e analíticas em pequena escala, por outro lado, se beneficiam com tamanhos de grânulos na faixa de 3–5 μm.

A escolha do ligando é frequentemente governada pelo princípio de que quanto maior a hidrofobicidade da molécula a ser purificada, menor é a necessidade de o ligante ser hidrofóbico. Esse princípio também levou à regra de que peptídeos e oligonucleotídeos sintetizados quimicamente são melhor separados com ligantes C18 e que proteínas e peptídeos recombinantes são melhor separados com ligantes C8.

A densidade dos ligantes imobilizados na superfície dos grânulos, a química de cobertura e o tamanho dos poros dos grânulos são outros fatores a serem considerados para uma separação de fase reversa bem-sucedida.


A fase móvel na cromatografia de fase reversa

Muitos protocolos RPC usam uma mistura de água e um solvente orgânico miscível (por exemplo, acetonitrila ou metanol) como a fase móvel. O objetivo do solvente orgânico é manter a polaridade em um nível baixo o suficiente para o soluto se dissolver na fase móvel e ainda alto o suficiente para facilitar a ligação da molécula preferida com a matriz estacionária.

Em alguns cenários, agentes de emparelhamento de íons, como ácido trifluoroacético, também podem ser adicionados. Uma vez que a molécula de interesse está ligada à matriz da coluna, ela é feita para se dissociar diminuindo ainda mais a polaridade, aumentando a concentração do solvente orgânico na fase móvel.

Esse processo de variação da quantidade de solvente orgânico na fase móvel para separar uma molécula de interesse é chamado de eluição gradiente.


Utilização do método na prática

A cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) tornou-se uma ferramenta poderosa para a análise de peptídeos e proteínas pelas seguintes razões:

  • Estabilidade testada da matriz em uma variedade de cenários de fase móvel
  • Reprodutibilidade de separações
  • Excelentes resoluções alcançáveis ​​para moléculas de interesse (intimamente relacionadas ou estruturalmente distintas)
  • Recuperações e rendimento apreciáveis
  • Facilidade de separações proporcionada por eluição gradiente

Por todas essas razões, RP-HPLC se tornou o método de escolha para a maioria das separações baseadas em HPLC. RP-HPLC tem desempenhado um papel importante na separação de biomoléculas (proteínas, peptídeos, nucleotídeos) de uma ampla variedade de moléculas sintéticas e biológicas, para aplicações analíticas e preparativas.

Devido à versatilidade dos sorventes de fase reversa em relação aos sorventes de fase normal, eles são usados ​​em mais de 80% das separações cromatográficas analíticas realizadas atualmente. Os sorventes de fase reversa têm sido usados ​​com sucesso em aplicações como separação analítica de drogas, metabólitos e biomoléculas ativas, bem como extração de contaminantes em amostras ambientais.

O sucesso das aplicações de RP-HPLC vistas na análise e purificação de peptídeos, pequenos polipeptídeos e drogas farmacêuticas, no entanto, não foi possível na mesma medida com polipeptídeos maiores (> 10 kDa) e proteínas globulares, devido à perda de enzimas atividade e baixos rendimentos devido à desnaturação da proteína durante o processo de separação.