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Análises por HPLC ou UHPLC, como escolher a melhor coluna

Análises por HPLC ou UHPLC, como escolher a melhor coluna

Para as análises por HPLC ou UHPLC existem muitas opções para escolha de colunas cromatográficas. Como escolher a melhor coluna cromatográfica para análises por (U)HPLC?

Não existe uma maneira fácil para se escolher uma coluna cromatográfica para ensaios por cromatografia a líquido. Uma pesquisa simples pela internet podemos encontrar anúncios de fabricante de colunas (U)HPLC que oferece somente com a fase C18, mais de 50 diferentes produtos, com diferentes tamanhos de partículas e dimensões.

Portanto, se seu processo já for algo consolidado na literatura é aconselhável fazer, antes de tudo, uma pesquisa em artigos e notas de aplicação para encontrar o melhor posicionamento para seu método. Outra maneira usual é consultar os catálogos de fabricantes de (U)HPLC e de colunas cromatográficas.

Tendo tantas fases, dimensões, partículas e fases disponíveis, fica quase impossível construir um guia de escolha para colunas empregadas em análises por cromatografia a líquido, por isso, vamos (eu e meu parceiro Gilson Siqueira) registrar neste artigo os principais parâmetros à serem observados durante a escolha de uma coluna para (U)HPLC e algumas dicas básicas para o sucesso nesta etapa do processo analítico..

Quais os principais parâmetros à serem considerados durante a fase de escolha de uma coluna cromatográfica para ensaios por (U)HPLC?

Primeiro precisamos pensar na questão da pressão que seu sistema suporta. Se você tem um UHPLC (bombas que suportam pressão de mais de 1.000 bar), você pode utilizar qualquer coluna de HPLC clássica, mas para conseguir a melhor performance do seu sistema, opte por colunas de UHPLC com partículas sub 2 µm. Se você possui um sistema HPLC convencional, por conta das altas pressões geradas por colunas de partículas menores, você não poderá optar pela opção listada acima, ficando restrito ao uso de colunas de HPLC clássicas.

Uma vez definido se é possível ou não se trabalhar em alta pressão, os principais parâmetros para escolher a melhor coluna para um ensaio por (U)HPLC, são:

  • Comprimento da coluna;
  • Diâmetro da coluna;
  • Fases da coluna (reversa ou normal);
  • Enchimento da coluna;
  • Tamanho da partícula;
  • Tamanho dos poros;
  • Comprimento da coluna.

O comprimento de uma coluna de HPLC ou UHPLC influência diretamente os seguintes parâmetros: volume morto, tempo de corrida e volume de solventes (fase móvel).

Nos dias atuais, com a tecnologia disponível, há uma preferência por se trabalhar com colunas menores (50, 75 ou 100 mm de comprimento), para se obter uma maior resolução de picos cromatográficos e reduzir o tempo de corrida das análises, aumentando assim a produtividade analítica e qualidade dos resultados.

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Diâmetro da coluna

Para a escolha do diâmetro interno da coluna tem-se preferido trabalhar com tamanhos menores, de 3,0 mm ou 2,1 mm, ao clássico de 4,6 mm, pois reduz o uso de solvente e torna sua corrida mais rápida e é compatível com detectores de MS.

Fases da coluna

Em colunas de fase normal os compostos apolares eluirão primeiro que os compostos polares, já em colunas de fase reversa os compostos polares eluirão primeiro que os compostos apolares.

As colunas de fase reversa são as colunas mais utilizadas pelos laboratórios em geral, por apresentarem diversas vantagens em relação às colunas de fase normal, como por exemplo: trabalhar na faixa de pH de 2 a 9, permitir o uso de água como fase móvel, etc.

Enchimento da coluna

O primeiro passo ao escolher o recheio da coluna é olhar para seu composto-alvo, sua estrutura e seus grupos funcionais.

O material mais utilizado como base para as colunas cromatográficas é a sílica. Algumas propriedades justificam sua utilização, como: a pureza, ausência de íons metálicos, formato das partículas, esférico ou irregular, tamanho das partículas e sua distribuição. Temos dois tipos de sílica, tipo A e tipo B, a sílica do tipo B é menos ácida e por isso resultam em picos com menos cauda quando seu analito é polar ou ionizável.

As colunas C18, fornecem bom formato de pico e o intervalo de pH que ela suporta é bem amplo (pH 2 a 9). Esta fase pode ser usada com sistemas de 100% de fase aquosa e são melhores na retenção de analitos polares.

Se os solutos de interesse não forem bem resolvidos com a coluna C18 pode-se tentar as colunas CN e as de Fenil, que podem das diferenças significativas na seletividade das fases alquil de cadeia reta para afetar a separação.

As fases com CN interagem muito bem com solutos básicos que contenha Nitrogênio e Halogênios. A retenção é governada pela hidrofobicidade e interações dipolo-dipolo.

Já as fases de Fenil interagem fortemente com analitos que contenham sistemas de elétros p (aromáticos e insaturados).

Tamanho das partículas de enchimento

Tamanhos menores de partículas trazem maior eficiência; no entanto, isso geralmente ocorre à custa de um aumento na pressão do sistema. As partículas mais amplamente utilizadas para sistemas HPLC têm 5 µm de diâmetro e proporcionam eficiências muito razoáveis quando usadas com os sistemas tradicionais de HPLC. Outras partículas com diâmetros como 3,0 µm ou 3,5 µm fornecem resolução mais alta e tempos de análise mais curtos, mas cuidado com aumentos na pressão de retorno do sistema e também note que o tamanho da partícula também reduz a porosidade da “frit” de retenção.

Tamanho dos poros das partículas de enchimento

O tamanho dos poros descreve o diâmetro médio dos poros dos poros na superfície do material empacotado. Poros de 6–12 nm são usados com analitos com peso molecular abaixo de 2000 Da e poros de 30 nm são usados para analitos acima de 4000 Da. Para o intervalo de 2000–4000 você deve experimentar para ver qual tamanho de poro dá a melhor retenção e eficiência.

Colunas de poros mais largos tendem a ser mais “carregáveis” – isto é, mais massa de analito pode ser aplicada antes que a deterioração da forma de pico (assimetria) se torne um problema.

 

Referências

http://www.ufjf.br/quimica/files/2016/08/AULA-HPLC.pdf

https://www.agilent.com/cs/library/catalogs/Public/5991-1059PTBR.pdf

http://www.chromatographyonline.com/hplc-column-selection

An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development by Craig S. Young and Raymond J. Weigand, Alltech Associates, Inc. 2051 Waukegan Road • Deerfield, IL 60015