As proteínas são a chave para nossa compreensão do desenvolvimento de doenças. Os cientistas da LGC produziram padrões de referência para análise de proteínas com a intenção de melhorar a robustez analítica.
As proteínas são grandes moléculas biológicas constituídas por sequências lineares de aminoácidos mantidas juntas por ligações peptídicas. As proteínas são essenciais em qualquer organismo vivo e desempenham uma ampla gama de funções; eles agem como enzimas na catalisação de reações bioquímicas, como anticorpos na resposta imune e têm um papel fundamental na replicação do DNA.
As proteínas desempenham um papel crítico em nossa compreensão do desenvolvimento e do estado da doença e estão se tornando cada vez mais importantes como biomarcadores clínicos para informar as decisões diagnósticas e terapêuticas.
Caracterização e quantificação de proteínas
A análise de proteínas, chamada de “proteômica”, é a identificação, caracterização e quantificação em grande escala de proteínas em um sistema biológico. No entanto, a otimização e validação de métodos proteômicos permanecem altamente desafiadores devido à variabilidade biológica natural das células (a composição da proteína varia de célula para célula e de tempos em tempos), a complexidade das amostras e a grande faixa dinâmica das concentrações de proteína.
Uma técnica amplamente utilizada para análise proteômica é a espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC-MS). Em estudos de proteômica desse tipo, as proteínas de interesse não são analisadas intactas. Em vez disso, eles são cortados em pedaços – conhecidos como peptídeos – por uma enzima (tripsina) antes da análise por LC-MS.
Como resultado, os analitos reais sendo medidos são os peptídeos, que são substitutos dos analitos reais de interesse, as proteínas.
Consequentemente, ter uma compreensão completa da variabilidade analítica associada à etapa de digestão enzimática é criticamente importante para determinar se qualquer diferença observada na composição da proteína é devido a verdadeiras variações fisiológicas na amostra biológica ou como resultado da variabilidade analítica.
Há, portanto, uma exigência de padrões e materiais de controle de qualidade para apoiar a otimização e validação de experimentos proteômicos, a fim de permitir a descoberta e maior compreensão de biomarcadores apropriados.
Após uma revisão dos Padrões de referência para análise de proteínas disponíveis comercialmente e consulta com cientistas de uma variedade de organizações acadêmicas e industriais, os especialistas em metrologia da LGC desenvolveram um protótipo de material de controle de qualidade (QCM) para ajudar a monitorar a reprodutibilidade da etapa de digestão enzimática tríptica usada em experimentos proteômicos.
O QCM compreende uma mistura de proteínas e peptídeos marcados isotopicamente que foram cuidadosamente selecionados e otimizados para análise proteômica de amostras humanas. O QCM funciona como um padrão interno para uso durante a digestão tríptica e fornece aos analistas uma ferramenta para otimizar e validar este estágio de seu projeto experimental para garantir a digestão de proteínas precisa e reproduzível.
O QCM foi avaliado por seis laboratórios independentes que realizam análises proteômicas. Cada laboratório analisou o QCM de acordo com seus protocolos normais de digestão enzimática e nas plataformas analíticas usadas rotineiramente em seus laboratórios. Ao aumentar o QCM em amostras reais, os laboratórios foram capazes de avaliar a reprodutibilidade de seus procedimentos de digestão e identificar fontes de variabilidade dentro dos métodos usados.
Confiabilidade das medidas proteômicas
Os estudos demonstraram como tal QCM pode ser usado para melhor compreender as fontes de variabilidade associadas à etapa de digestão enzimática na análise proteômica e para auxiliar no desenvolvimento e validação dessas medições.
Seu uso em maior escala requer investigação de fatores como estabilidade e homogeneidade do QCM, no entanto, este trabalho mostrou que ele tem o potencial de ajudar a fornecer confiança na confiabilidade das medidas proteômicas e seu papel no diagnóstico de biomarcadores e no desenvolvimento de novos medicamentos. terapias.
O Dr. David Knight, do Facility of Life Sciences da University of Manchester, comenta:
“A participação no ensaio realmente nos ajudou a concentrar nossos esforços no desenvolvimento de metodologias de quantificação de proteínas, tanto em destacar questões em nosso processamento interno quanto na comparação de nossas metodologias com as de outros grupos altamente experientes em todo o Reino Unido.”
O trabalho descrito aqui foi realizado pelo LGC como parte de seu papel como Instituto Nacional de Medição designado e foi financiado pelo Sistema de Medição Nacional do Reino Unido.
Fonte: LGC Group