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Coluna de fase estacionária para análise e purificação sob fase reversa

Coluna de fase estacionária para análise  e purificação sob fase reversa

A Coluna de fase estacionária Kromasil EternityXT foi usada para análise e purificação sob cromatografia de fase reversa para medir a estabilidade em análises com alto ou baixo pH.

Os materiais de cromatografia à base de sílica são normalmente considerados estáveis ​​na faixa de pH 2 a pH 8 e separações e purificações são normalmente realizadas sob essas condições. No entanto, existem aplicações onde um pH mais alto pode ser usado para obter melhores purificações para atingir maior pureza e / ou rendimento. A coluna de fase estacionária EternityXT é ideal para instalações de produção que precisam trabalhar com uma faixa extensa de pH porque é estável sob condições de pH baixo e alto.

Uma extensão do pH para condições mais alcalinas pode melhorar a seletividade e resolução entre o principal composto de interesse e suas impurezas, aumentar a carga ou a produtividade de, por exemplo, substâncias contendo amina onde pH> 8 pode ser benéfico.

A estabilidade química do material EternityXT foi testada por um longo período de tempo e comparada com materiais de sílica clássicos disponíveis no mercado hoje, monitorando a mudança em k ‘com o tempo para o fenantreno em temperatura elevada usando tampão de carbonato de 10 mM em pH 10,5.

Conforme visto na figura abaixo, as mudanças de k ‘são relatadas em relação ao tempo para: Kromasil EternityXT 10 μm C18, C8 e C4, bem como Kromasil 10 μm C18 e um material C18 concorrente. Os materiais Eternity XT mostram uma estabilidade química muito alta ao longo do estudo, independentemente da derivatização. Ainda assim, Kromasil EternityXT C18 e C8 permanecem inalterados ao longo dos estudos, C4 experimenta uma ligeira diminuição em k ‘com o tempo, mas o% k’ varia apenas 5% em 120 horas sob condições adversas.

Como esperado, os materiais de sílica tradicionais têm estabilidade química inferior em pH 10,5. Ainda assim, o Kromasil 10 μm C18 demonstrou ter estabilidade química superior além de sua faixa de pH tradicional de operação, o que se reflete nos resultados apresentados na figura 1.

Coluna de fase estacionária para análise e purificação sob fase reversa
Figura 1: Estabilidade química de materiais C18 de 10 μm em alto pH e altas temperaturas
  • Condições
  • Substância: Fenantreno
  • Condições de hidrólise
  • Na fase móvel: acetonitrila / carbonato de amônio 10 mM, pH 10,5 (10/90)
  • Quociente de vazão: 0,2 ml / min
  • Temperatura: 60 ° C
  • Condições analíticas
  • Na fase móvel: acetonitrila / água (70/30)
  • Quociente de vazão: 1 ml / min
  • Temperatura: 25 ° C

Para descrever ainda mais a estabilidade química dos materiais da coluna de fase estacionária Kromasil EternityXT, cromatogramas analíticos para monitorar o estudo de hidrólise para uma das fases são mostrados na Figura 2. Estes são cromatogramas de injeções analíticas para Kromasil EternityXT 10 μm C18 com hidrólise de 12 horas entre cada injeção. O cromatograma superior corresponde ao início do estudo e o cromatograma inferior é o último resultado do teste. Os resultados mostrados aqui indicam que k ‘permanece constante para todos os compostos na mistura da amostra. É de notar que o mesmo frasco de amostra foi usado para este estudo. Como se sabe, o tolueno é um composto volátil e, embora o tempo de retenção do tolueno seja mantido durante este estudo, sua altura e área do pico diminuem com o tempo, devido à evaporação do composto no frasco da amostra.

cromatogramas da hidrólise de um material C18

Figura 2: Resultados cromatográficos analíticos do estudo de hidrólise de EternityXT 10 μm C18 em pH alto e altas temperaturas

  • Condições
  • Substâncias: 1 = nitrato de sódio, 2 = ftalato de dimetila, 3 = tolueno, 4 = bifenil, 5 = fenantreno
  • Condições analíticas
  • Na fase móvel: acetonitrila / água (70/30)
  • Quociente de vazão: 1 ml / min
  • Temperatura: 25 ° C

Da mesma forma que pequenas bases orgânicas que mostraram ter separação, resolução e carregamento melhorados em pH alto, certas separações e isolamentos de peptídeos podem se beneficiar por serem realizados sob pH básico. A Figura 3 ilustra a purificação de um peptídeo de 3,5 kDa em pH 8, onde material de sílica clássico é normalmente usado e comparado com pH 9,5 usando EternityXT. Conforme mostrado na Figura 3, a pureza e o rendimento são superiores ao realizar a purificação em pH mais alto.

Este estudo mostrou que a Kromasil EternityXT organosilano reforçado com sílica funcionalizada com C4, C8 e C18 tem alta resistência química sob condições alcalinas adversas, mantendo o alto desempenho. Esta estabilidade em pH alto expande a faixa de trabalho para usuários quando eles precisam separar e purificar compostos, como o exemplo de peptídeo representado aqui.

cromatograma para purificação de peptídeo em pH alto

Figura 3: Purificação de peptídeo em pH alto

  • Condições preparativas
  • Coluna: Kromasil EternityXT-C18 4,6 × 250 mm 
  • Fases móveis
  • @ pH 8: N-propanol / tampão TRIS 100 mM, pH 8,0
  • @ pH 9,5: n-propanol / carbonato de amônio 100 mM pH 9,5
  • Gradiente: 0-30 min: 5%, 35 min: 10%, 40 min: 23%, 100 min: 31%, 110 min: 45% n-propanol
  • Quociente de vazão: 0,55 ml / min
  • Análise de frações
  • Coluna: Kromasil 100-3,5-C4 4,6 x 100 mm 
  • Na fase móvel: acetonitrila / tampão fosfato 25 mM, pH 2,5
  • Gradiente: 0 min: 43%, 40 min: 46,5% de acetonitrila
  • Quociente de vazão: 1 ml / min
  • Temperatura: 25 ° C
  • Detecção: UV @ 214 nm
Partes desta nota foram publicadas anteriormente como um artigo em Chimica oggi – Chemistry Today